常见问题解答

1. 单细胞悬液如何制备？公司的悬液制备经验如何？: 答：制备单细胞悬液时，首先要看样本类型：针对已经处于悬浮状态的细胞、磁珠富集的细胞或流式分选的细胞，只需要进行清洗和计数；但在处理组织类样本时，必须首先通过机械法或酶解法进行解离，为了达到最佳的处理效果，需要对实验方法进行多次优化。目前寻因生物的实验团队，已完成单细胞项目500+，有8000+的组织解离经验，并基于此对各类型组织做了难度归档和注意事项，在单细胞测序行业内属于top1 级别。
2. 组织采样有哪些注意事项？: 答：取样注意事项如下： 1.在取样时（尤其是病变组织）尽量避免取到坏死、钙化、硬化、纤维化的部位； 2.如手术为电刀切割组织，去除因与电刀接触的坏死组织； 3.确保目标组织术时无冰冻； 4.在取样后可对组织进行修剪，尽可能快速去除非目标部位然后尽快放入组织保存液中，以免影响最终测序结果。 5.消化系统组织需多用PBS或者生理盐水多次冲洗。 6.如是高龄动物标本请尽快送实验室进行解离。 7.实验模型是否会对细胞有影响，如小鼠肺部打入二氧化硅颗粒后，二氧化硅密度和细胞类似，后续无法去除干净。 8.药物治疗是否会对细胞有影响，如肿瘤治疗后，大部分肿瘤细胞凋亡后形成的碎片不易与细胞区分，影响细胞质检有核率。
3. 样本运输时有哪些注意事项？: 答：样本运输注意事项如下： 1.所有样品寄出前需将样品名称，取样时间，以及组织类型在管壁上标记清晰 2.所有样品寄出前后需告知本公司业务员，并及时填写电子版需求单以及快递单号，便于实验室接受样品并安排实验 3.如是传染性样品，请务必提前告知本公司业务员 4.提前与寻因生物业务员联系，获取组织保存液（或自备保存液：MACS Tissue Storage Solution，美天旎，货号130-100-008），标准为1.5mL/样本，如组织较大可申请使用5ml/样品保存液。切取约200mg的组织（黄豆粒大小），如组织较多，可取2-3份备用或申请5ml装。 5.将获得的组织用PBS或生理盐水洗掉组织中的血液。 6.将洗后的组织样本放入加满组织保存液的1mL（或者更大）保存管中。 7.将保存管用封口膜密封好，放入合适的泡沫盒中，并在泡沫盒子中放2~3个-20℃冷冻过的生物冰袋，将泡沫盒封好。 8.联系快递公司邮寄。邮寄前请提前联系公司工作人员，以免样本到达公司无人处理。要求组织样本在48h内到公司。
4. 细胞悬液的数量和活性如何进行判定？: 答：可以使用台盼蓝染色，用显微镜观察计数。原理是由于活细胞的细胞膜具有选择透过性，可以阻拦台盼蓝，因而不被染色。死细胞的细胞膜通透性较大，因此可被台盼蓝染成蓝色。具体步骤如下： 1、20ul单细胞悬液与20ul台盼蓝混匀； 2、吸取20ul加入改好盖玻片的细胞计数板； 3、显微镜下观察统计细胞数量和颜色，死细胞浅蓝色，无光泽，活细胞不着色正常形态，有光泽； 4、统计一个视野内计数区细胞总数和死细胞数，按公式计算出细胞浓度、总量和活性。可多个视野取平均值。也可以使用细胞自动计数仪检测细胞数目和活性，例如Countstar系列。其原理为使用 Countstar Rigel S2 系统，通过吖啶橙和碘化丙啶细胞核核酸结合的荧光染料AOPI。AO 可以穿透活细胞和死细胞对细胞核进行染色并发出绿色荧光，PI 进入死细胞对细胞和进行染色并发出红色荧光。因此AO/PI 为细胞核染料，可以准确区分活细胞与死细胞，而且可以排除杂质或者非特异细胞的干扰，进行精准的浓度活率检测。
5. 如果组织中某些细胞有自发颜色，也能通过细胞自动计数仪进行活性检测吗？: 答：如果组织内包含一些自发色的细胞，比如脉络膜或者黑色素瘤组织的某些黑色的细胞，就没办法通过自动计数仪进行荧光计数了。这种情况就需要操作人员通过显微镜观察细胞膜的完整性来判断细胞活性大小。
6. 为什么细胞培养液及缓冲液中不能含有Ca 2+和Mg 2+离子？: 答：因为Ca 2+和Mg 2+离子等会影响反转录酶的活性从而影响到后续cDNA的生成，最终导致建库的风险增加。
7. 酶解法制备单细胞悬液时，针对我的组织应该选择哪种酶进行解离？: 答：目前制备单细胞悬液时，需要根据组织和细胞类型选择适用性较强的酶，甚至可以使用多种酶的混合。列表中展示部分酶的种类和适用参考，如自行解离不成功的话，建议交给我们寻因生物的单细胞解离团队进行处理。
8. 制备单细胞悬液过程中，细胞出现了较多的结团现象怎么办？: 答：首先应该先判定下出现结团现象的可能的原因，一般原因可能有以下几种情况，可以根据原因来进行针对性优化 1：组织特性，例如血管或皮肤等样本本身容易出现细胞结团现象；可判定细胞总数和结团率，如数量足够，结团率在20%以下，可经细胞筛过滤后再进行后续处理 2：酶解不完全，导致细胞间连接尚未分离或者；可再重新优化酶解的温度和时间等条件。 3：离心过程中速度太大或细胞悬液静置时间较长，导致的自然结团；可用无钙镁平衡盐溶液重新洗涤细胞，也可以加入适用的EDTA，但注意浓度不可超过2mM。 4：酶解过程中细胞损伤，导致DNA释放到悬液中，可能会附着到未消化的组织，影响蛋白酶的进一步消化导致结团或者附着到细胞上导致聚集成团；可少量添加 DnaseⅠ，浓度不宜超过0.1 mg/mL ，注意轻柔吹打细胞，从而可以消化游离DNA而不损伤完整细胞。
9. 制备完细胞悬液后，我是否需要分选细胞来进行后续地分离标记？: 答：制备完悬液后，要不要分选细胞，主要看研究地目的。如果目的是为了获得组织内细胞组成地全貌，或者需要获取不同细胞间地互作关系，就可以不分选细胞；如果目的是只关注其中地特定类型细胞，比如免疫细胞，或者关注地细胞数量较少，需要多样本富集，那么就需要做一步分选；从单细胞研究趋势和文章数量激增地角度来看，分选目标细胞进行更细化地课题研究可能是个趋势。
10.SeekOne® MM单细胞转录组的cDNA和文库质检方法和标准是什么？: 答：cDNA 质检方法：使用 Qubit 测 cDNA 样本浓度，Agilent 检测 cDNA 样本的片段与峰型。 cDNA 质检标准：片段范围为 200-5000bp，主峰在 1000-2000bp 之间，判定合格。文库质检方法：使用 Qubit 检测文库样本浓度，Agilent 检测文库样本的片段与峰型。文库质检标准：文库峰型在 250-1500bp，主峰在 350-700bp 之间，无小接头污染，符合测序要求。
11.SeekOne®单细胞转录组构建的测序文库适用的测序平台有哪些？: 答：该文库目前适用于Illumina高通量测序平台，如使用华大智造的MGISQ测序平台，则需要更换测序接头。
12.寻因生物提供纯测序和分析服务吗？: 答：提供，可将按照SeekOne® MM试剂盒流程自行构建的文库邮寄给我们（-20℃运输）即可。
13、SeekOne® MM系列建议的单细胞转录组测序量是多少？: 答：测序策略PE150bp，建议每细胞测序量不低于50K reads，总数据量为细胞数目×50K reads。按照捕获6000个细胞计算的话，建议每个样本默认100g数据量起。
14.经过SeekOne® MM试剂盒构建的测序文库是碱基平衡文库吗？: 答：我们的建库流程设计中，针对UMI序列专门进行了移码设计，可一定程度上降低对平衡文库的依赖，不过虽然有移码设计，但最好还是加一点平衡文库，预计最多需要15%左右即可。
15.SeekOne® MM试剂盒提供的测序接头完整吗？: 答：该试剂盒给出的最终测序文库是不缺引物序列和接头序列的，说明书中提供的是我们合成的接头引物，实际建完库跟Illumina官方的接头序列一致。具体序列如下： I5：5‘AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT3’ I7： 5’TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC[i7]ATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG3’
16.SeekOne® Tools是寻因专门的分析软件吗？与第三方软件如Seurat是否兼容？: 答：SeekOne® Tools是寻因自主开发的单细胞数据分析软件，与SeekOne MM® /DD单细胞转录组建库试剂盒配套使用，在Linux系统下安装后方可使用，需要客户方有计算资源且有一定的生信基础，这个软件包可完成下机数据的基本质控。该软件的性能良好，可兼容多种单细胞技术平台数据。另外，经过 SeekOne® Tools分析得到的细胞-基因表达矩阵，也可以直接导入到第三方软件例如Seurat软件包进行后续的分析工作。
17.单细胞数据质控中的Fraction reads in cells指标是什么意思，达到多少认为是可用的数据？: 答：这个指标用来表示细胞的有效reads比例，接下来都是以这个有效reads进行后续的分析工作，常常用来判断样本和实验的有效性，一般和样本组织细胞的状态和活力较差，胞外游离RNA较多或者制备悬液过程中细胞洗涤不充分有关，所以该指标低于65%的情况下，需要重新回顾下整个项目情况。一般而言，如果细胞分群的结果符合预期的话，可以通过适量的数据加测，一定程度上来规避指标不高的问题。
18.单细胞数据质控中线粒体基因的UMI比例代表什么意思？: 答：线粒体基因的UMI比例通常被认为与细胞凋亡和损伤相关，一般线粒体膜通透性增加，会诱导凋亡因子（AIF）等分子释放进入细胞质基质，破坏细胞结构。一般来讲，我们会通过细胞的线粒体基因UMI数目绘制小提琴图来设定某个阈值，过滤掉阈值之上的细胞。该指标不固定，与样本实际情况相关。例如，在代谢活性极高的组织中（例如肝脏），线粒体基因的UMI比例也会呈现较高的水平表达。所以，可以综合考虑各项质控标准，如果其他指标相对正常，高线粒体基因UMI比例可能是源于样本特征；如果其他指标也出现异常，线粒体基因比例偏高，则考虑实验制备时组织状态和细胞凋亡损伤，可以根据情况考虑数据加测或者重新制备单细胞悬液样本。
19.如果根据常规参数过滤后，细胞数仍超过10,000，但是其他的质控参数都很好，还有哪些参数可以设置或者怎么设置来过滤细胞呢?: 答：目前SeekOne® MM单细胞转录组试剂盒捕获到每个样本的细胞建议最多为10,000，细胞数量再进一步增加会使微孔中多细胞概率大大上升，影响到后续分析，但是确实不排除可以尝试更多细胞捕获的做法。如果这些细胞已经用基因数量、转录本数量和线粒体基因比例等参数过滤，那么说明这些细胞是合格的，不需要进一步过滤，可以进入后续分析。
20.细胞聚类后，可以知道这些细胞亚型属于什么细胞吗？: 答：我们会对聚类出来的细胞进行细胞类型注释，通常来说有三种方式： 1.使用自动注释软件SingleR+Garnett，对聚类结果进行注释，没有人工干预； 2.基于寻因生物自主积累的单细胞marker数据库，对聚类结果进行细胞注释； 3.通过寻因生物细胞类型注释系统，基于客户提供marker或者以发表文章的marker对细胞类型进行详细注释和人工矫正。
21.在鉴定罕见细胞亚群时，需要多少细胞才能被鉴定从而聚类呢？: 答：这个主要是由罕见细胞亚群与其他群之间的差异来确定的，如果差异足够的话，几十个细胞，甚至几个细胞都是可能单独分群的。另外，对于感兴趣的亚群，可以选择再次聚类的方法，来找到罕见的细胞亚群。
22.单细胞转录组数据如何进行细胞通讯分析？: 答：配体和受体介导的细胞间的通讯，对于发育，分化和验证等各种生物学过程至关重要。如下图所示，我们主要通过单细胞转录组的细胞-基因表达数据，导入到Cellphone DB中，与数据库内已知的配体-受体关系对进行匹配，来获取实际项目中的细胞通讯关系。
23.在拟时序的分析中，什么是伪时间的开始？: 答：细胞的分化发育是一个有方向的不可逆过程，而拟时序分析就是根据不同的细胞状态来模拟细胞分化的过程。伪时间是衡量我们感兴趣的某细胞类型在整个拟时序轨迹当中处在一种什么状态的数值，而伪时间的开始一般指在细胞轨迹的构建中，最原始状态细胞或早期细胞所在的节点位置。目前拟时序分析中常用的是Monocle R包，在完整的包中已建立23730个基因和301个样本库。其分析的步骤是将测序的差异分析结果选取适合的 Marker 基因加载，再进行降维和排序后便可以得到拟时序轨迹，而特定细胞亚群在轨迹上的位置与根部（可能是一群祖细胞）的距离即为伪时间。自然，多个细胞亚群便可以有多个起点和轨迹。另外也可以通过细胞速率分析等，基于细胞的生长发育周期状态来辅助拟时分析的方向判断。如下图所示，基于拟时分析推测出谷氨酸能细胞谱系的发育，早期的谷氨酸能细胞发育为两个主要的细胞谱系：颗粒神经祖细胞系（GNPs）和谷氨酸能的小脑核细胞系（glutamatergic CN）。
24.单细胞转录组对生物学重复有要求吗？: 答：受限于单细胞转录组技术的常见样本来自于临床设计，所以单细胞转录组对于生物学重复没有严格的要求限制。临床样本，一般可以通过按照实验设计，增加每组的个体数目，提高数据结论的可靠性即可（例如研究乳腺癌肿瘤微环境，可以选择5个以上患有乳腺癌的个体，从整体解析细胞类型组成等信息）；动物模型样本等涉及人为处理因素的设计，一般建议设计2个生物学重复以上。另外考虑到单细胞悬液的制备对组织新鲜程度要求高，个体异型性较大，所以容易出现多批次实验产生的批次效应。一般针对生物学重复的评估也没有那么严格，只要在tSNE图上细胞分布大部分或者接近重叠，细胞亚群组成比例接近，则证明重复性是可以的。另外，就算重复性比较差的情况下，也建议先通过批次矫正分析的策略来减少批次效应对细胞分群分析的影响。
25. 临床样本有批次效应怎么办？: 答：批次效应（batch effect），表示样品在不同批次中处理和测量产生的与试验期间记录的任何生物变异无关的技术差异。首先要声明的是批次效应理论上在任何实验中都可能存在，且不能完全去除，只能降低。受限于临床样本采集的影响因素更多，我们可以从多个角度去尽可能地降低影响，例如：在实验环节，最好可以一次性收集样本+解离标记建库，如果实现不了地话，可以分批采样+标记建库的话，最好是成对的设计采样（如第一批：同一个病人的癌和癌旁；第二批：第二个人的癌和癌旁）。在分析环节，可以进行软件层面地批次矫正处理（可选Harmony，seurat自带校正等方法），把样本间地批次效应降低，最大程度保留细胞地真实聚类结果。